固定床生物反应器：使用MRC-5细胞在scale-X生物反应器中进行风疹疫苗的生产

从细胞培养瓶到具有 30 m² 细胞生长表面的 scale-X 固定床生物反应器的工艺优化和放大

摘要

由于风疹疫苗的交付缺口，全球风疹疫苗免疫接种在世界上某些地区仍然有限。在本文中，我们将展示一个 scale-X^TM carbo 固定床生物反应器（30 m²）如何成功地填补风疹疫苗接种工作中的抗原缺口。在所描述的实验中，使用 MRC-5 细胞生产风疹病毒，培养规模从细胞培养瓶转移放大到 scale-X 固定床生物反应器。首先细胞接种并培养在scale-X hydro固定床生物反应器中，随后进行几次工艺步骤优化（培养基消耗、接种密度和灌流研究）。当细胞显示在hydro中生长可行性成功后，该工艺成功从scale-X carbo 10 放大到 scale-X carbo 30中。在hydro中批量集中收获的目标病毒滴度为10⁶TCID50/mL，在放大到 scale-X carbo规模后也能达到。scale-X carbo 30的生产结果意味着一批可以生产超过 100 万剂疫苗。

简介

风疹尽管是一种病情轻微的疾病，但它被认为是一个公共卫生问题。风疹可导致先天性风疹综合征，进而导致流产、胎儿死亡和婴儿先天性畸形。风疹没有已知的治疗方法，但安全和非常有效的疫苗（一剂可降低97%的发病率）确实存在^[1]。减毒活病毒风疹Rubella疫苗通常与麻疹Measles和腮腺炎Mumps (MMR) 组合成三联疫苗，广泛用于免疫接种。尽管有疫苗，但即使在对其他病原体采取有效免疫政策的国家，风疹发病率仍然很高，这表明其可用性和免疫接种管理方案效率低下 ^[2]。部分低效率是由于可负担的疫苗供应不足，尤其是在新兴国家，这导致了疾病的死灰复燃或持续存在。 MMR 疫苗的全球产能约为 2.2 亿剂，而全球需求量为每年 4 - 4.5 亿剂，风疹是实现这一目标的限制性抗原。因此，GAVI全球疫苗和免疫联盟预计每年必须额外提供 2 亿剂风疹疫苗，以缩小与联合制剂中其他抗原的差距并满足常规和紧急情况的需求 ^[3]。

贴壁 MRC-5 细胞系，是一种源自肺成纤维细胞的人源细胞系，通常用于风疹疫苗的工业化生产，也用于生产其他几种病毒疫苗，包括甲型肝炎Hepatitis A（Merck的 Vaqta^®、GSK的 Havrix^®）和狂犬病疫苗（Sanofi-Pasteur 的 Imovax^®）^[4]。用贴壁细胞进行工业生产疫苗的传统技术包括滚瓶、细胞工厂和搅拌罐生物反应器中的微载体。固定床生物反应器是一种有价值且相对较新的替代方案，它使滚瓶和细胞工厂的许多人工培养步骤自动化，与搅拌罐中的微载体相比，大大简化了生产工艺，提供了可线性放大的的商业化生产。 Univercells Technologies 的 scale-X 固定床生物反应器系列，具有可线性放大的结构化固定床生物反应器解决方案，从研发（scale-X hydro，2.4 m² 生长表面）到临床（scale-X carbo 10 和 30 m²）和商业化（scale- X nitro，200 和 600 m²）应用。与其他市售的生物反应器相比， Scale-X 生物反应器中固定床独有的创新的固定床结构可实现均匀的细胞分布和可重现的流体流动，从而提高批次间的重现性。

材料，方法和设备

材料

病毒种子：在 CellSTACK^® 10（Corning, 美国）中生产几种工作病毒种子，并分装在冻存管和瓶子中，用于实验工作。工作病毒种子的滴度都超过 10^5.8 TCID50/mL。

细胞计数：scale-X 固定床生物反应器中的细胞密度评估是通过无菌操作从固定床上取预切取样条来实现的。取样条在细胞裂解缓冲液（试剂 A100 和 B，ChemoMetec，美国）中孵育预定的时间，然后使用结晶紫染色。使用血球计数板和光学显微镜来手动计数释放的细胞核。

接种液生产：用于生物反应器实验的接种液是在 T75 细胞培养瓶（Thermo Fischer，美国）和 CellSTACK^® 10（Corning，美国）中生产的。细胞生长至适合接种生物反应器的最终细胞数量。后续报告中会进一步说明接种密度。

用于细胞培养和病毒生产的scale-X生物反应器

scale-X hydro生物反应器

作为最小规模的固定床生物反应器，本研究中使用的 scale-X hydro 提供 2.4 m²的细胞生长表面积。一次性生物反应器在接种细胞之前通过高压灭菌器进行灭菌。 pH 和溶氧 (DO) 分别使用氧化还原和光学探头（Hamilton EasyFerm 和 VisiFerm，Hamilton Company，瑞士）测量，而温度 (T°) 使用标准 PT100 温度探头（Jumo Automation，德国）测量。蠕动泵对碱的添加，气体质量流量控制器对空气、氧气和二氧化碳的添加以及加热元件来确保 pH、DO 和 T° 得到维持。生物反应器连接到一个多管路套件，该套件为流体管理提供了完整的一次性解决方案，包括在细胞培养过程中必须的接种液、碱和补充培养基的添加。

图1: scale-X hydro生物反应器

scale-X carbo生物反应器

scale-X carbo具有两种尺寸的生物反应器（10 和 30 m²的生长表面），通过与细胞培养相同的界面控制在线 TFF 浓度。一次性生物反应器在细胞接种前通过高压灭菌器进行灭菌。控制（pH、DO 和 T）与 scale-X hydro（见上文）相同。 scale-X carbo兼容GMP标准，控制系统符合21CFR part 11 ，并为生物反应器可提供GMP材料验证包。

图2: scale-X carbo生物反应器

贴壁细胞培养的病毒生产过程

风疹病毒的生产工艺可概括为以下步骤：

1. 细胞在生物反应器中的接种和扩增；

2. 生长培养基漂洗；

3. 病毒吸附；

4. 病毒扩增；

5. 病毒生产和收获。

本文描述的工艺优化路径如图 3 所示。首先是将预先建立的培养皿工艺（在 T75 培养瓶中，作为比较生物反应器的对照）不做工艺优化，直接转移scale-X hydro生物反应器，用于可行性评估。然后，工艺优化的重点是简化种子培养、确定最佳培养基消耗、开发灌流工艺，以及在不影响病毒产率的情况下从最终病毒生产阶段去除血清。最后，先在 scale-X carbo 10 中进行放大，然后在 scale-X carbo 30 中进行放大，以保持产率为目标。

工艺优化路径

从细胞培养瓶到scale-X hydro

工艺优化的第一步是将静态细胞培养瓶的工艺直接转移到 scale-X hydro生物反应器。这在添加了 10% FBS 的 DMEM 细胞生长培养基中，使用了 10,000 cells/cm² 的接种密度，培养基与固定床表面的比例为 0.17 mL/cm²。细胞培养以循环模式进行，培养基从外部容器通过生物反应器循环，确保达到单位表面积的目标体积（见图 4）。

图3:工艺优化路径：细胞培养瓶到scale-X hydro和scale-X carbo

优化scale-X hydro生物反应器中的接种密度并确定最佳培养基消耗

决定研究是否可以降低接种密度以简化种子培养。这是通过将对照工艺（例如 10,000 cells/cm²）与 6,500 cells/cm²和 5,000 cells/cm²的较低接种密度进行比较来完成的。

图 5 所示，在 scale-X hydro 中，接种密度可以从 10,000 cells/cm² 成功降低到 5,000 cells/cm²，只要延长两天（即从 4 天到 6 天），不会显著影响细胞培养的性能（从细胞密度（分别为 115.6K 和 105.2K cells/cm² 判断）) 和生长速率（分别为 0.86 和 0.73 PDL/天）判断）。

达到目标病毒产物浓度（使用血清）

风疹病毒的感染和病毒生产分两个不同的阶段进行：初始的病毒扩增，紧接着是病毒实际生产步骤，在此期间收集病毒。在这项研究中，风疹病毒的目标滴度是 10⁶ TCID50/mL。

该值被视为可以评估工艺成功的基准（等于或高于该值为宜）。

使用含血清的生产培养基 (4% FBS) 以固定的 MOI (MOI = 0.13) 进行病毒感染。图 7 显示 3 天后达到的病毒滴度超过基准目标 (10⁶ TCID50/mL)。用于细胞生长的培养基体积与表面之比为 0.17 mL/cm²（请注意，这与细胞生长培养基不同）并且每两天更新一次（即，当它被完全消耗时）。

灌流工艺应用

使用灌流工艺是可取的，因为它可以实现在线工艺，其中细胞培养可以与澄清和纯化步骤链接在一起。因此，这仅适用于病毒生产阶段，其中包含产品的工艺流可以在线纯化。使用与前文描述相同的的含血清培养基与可用于生产的表面积的比例（例如 0.17 mL/cm²），但分散到 2 天中，即培养基供应率为 0.085 mL/cm²/day。图 8 显示感染三天后病毒滴度超过 10⁶ TCID50/mL的目标（数据仅显示到第 10 天）。

从病毒生产阶段去除血清

去除动物血清是生产风疹病毒的监管要求^[5]。初步研究表明，在病毒生产阶段去除血清意味着无法达到 10⁶ TCID50/mL的目标滴度。                                                                                

可能有两个因素导致观察到的滴度下降。首先，病毒扩增期间（即产生病毒的两个阶段中的第一个阶段）细胞中残留的血清太低，并且扩增阶段持续时间过短。其次，血清稳定了病毒，它的去除应该用稳定剂代替。

实验通过分别使用人血清白蛋白 (HSA) 或固定成分的蔗糖/磷酸盐/谷氨酸 (SPG) 混合物（未公开）进行测试的。

两种假设都在细胞培养瓶中进行了测试，结果表明，通过将病毒扩增期延长至 3 天并添加 HSA，在病毒生产阶段无需血清即可达到目标产物浓度。然后在 scale-X hydro生物反应器中重复了实验并获得类似的结果。

从scale-X hydro规模放大到scale-X carbo 10 和 30

该工艺首先从 scale-X hydro 放大到 scale-X carbo 10，然后放大到 scale-X carbo 30。直接应用 scale-X hydro 中定义的接种密度和培养基消耗的参数。接种液的质量对于确保 scale-X hydro 和 scale-X carbo 之间的均匀细胞分布和等效细胞生长至关重要。研究了以下几个因素来确保均质性和细胞生长等效性：

 细胞单个化：确保细胞在从接种培养皿中酶解消化过程中有适当的单个化；

 时间：缩短接种液收集和细胞接种之间的时间；

 操作：批次模式进行接种；

 操作体积：确保生物反应器加入了最佳体积的接种液。

确保应用这些因素，在 scale-X carbo 10 和 30 中实现的生长曲线和最终细胞密度与在 scale-X hydro 中看到的相同（数据未显示）。此外，通过应用在 scale-X hydro 中开发的从病毒生产阶段去除血清的相同工艺，scale-X carbo 10 和 30 中的产物滴度分别达到 10^6.15 和 10^5.95 TCID50/mL（见图 10）。尽管scale-X carbo 30低于目标滴度（例如 10⁶ TCID50/mL）时，放大仍被认为是成功的。

总结

通过将在细胞培养瓶中的工艺（由 Batavia Biosciences 开发）转移、优化和放大到 scale-X 固定床生物反应器的整个过程中，结果表明预先设定的目标病毒浓度 (>10⁶ TCID50/mL) 可以达到（10^5.95 TCID50/mL - 见图 10 - 被认为在该工艺成功标准的可接受范围内），同时确保接种获得可预测的细胞生长曲线，优化培养基消耗，开发灌流生产工艺，并从病毒生产阶段去除血清。

建立的无血清灌流工艺首先放大到 scale-X carbo 10，然后放大到 scale-X carbo 30，并且成功达到目标滴度。

Batavia Biosciences将进一步开发和优化风疹疫苗生产工艺（见图 11）（包括下游工艺）。根据现有数据，可以估计使用 scale-X carbo 30 生物反应器每批次可生产超过 100 万剂。这是根据实验数据计算如下。

根据预期目标，该工艺还可以进一步扩大到 scale-X nitro，其细胞培养面积高达 600 m²，线性转化为每批次 2060 万剂。

图11: 优化的风疹疫苗生产工艺，在病毒生产阶段不使用血清，并采用灌流工艺

参考文献

[1]  World Health Organization, "1," 4 October 2019. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rubella. [Accessed 26 July 2021].

[2]  Strategy Advisory Group of Experts on Immunization , "2018 Assessment Report of the Global Vaccines Action Plan," World Health Organization, Geneva, 2018.

[3]  "Global market study Measles-containing vaccines (MCV)," World Health Organization, 2020.

[4]  M. Wadman, "Fact-checking Congress’s fetal tissue report," American Association for the Advancement of Science, 5 January 2017.

[5]  "Quality of biotechnological products: viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin," European Medicines Agency, London, 1997.

[6]  FDA, "Highlights of prescribing information - Mumps-MeaslesRubella virus vaccines," Accessed on 14/07/2021. [Online]. Available: https://www.fda.gov/media/75191/download.

致谢

Univercells 与合作伙伴 Batavia Biosciences 一起获得了比尔和梅琳达.盖茨基金会的资助，用于开发低成本疫苗制造平台来生产 GMP M&R 药物。本研究中描述的项目是与联盟成员 Batavia Biosciences 和 Univercells（由 Quantoom Biosciences 和 Univercells Technologies 代表）合作进行的。