scale-X固定床反应器：用于疫苗生产

工艺转移：用于 WI-38，Vero 和 CEF 产物的四种候选病毒疫苗

简介

基于细胞的疫苗生产传统上依赖贴壁细胞系来生产。scale-out横向扩展而非scale-up纵向扩展的鸡蛋或滚瓶等传统技术仍在广泛使用，但需要大量洁净室空间和大量人工操作。使用此类技术会导致高昂的固定资产和运营费用，最终影响疫苗的可负担性及其可获得性。与2D静态培养技术相比，使用微载体的搅拌罐生物反应器技术具有可规模放大和自动化生产的优势。然而，这种工艺受到开发和操作复杂性的影响，例如球转球的细胞转移、剪切力的管理、较大的操作体积和繁琐的种子扩增步骤。固定床生物反应器通过提供与搅拌罐生物反应器相同的自动化水平、显著减少的占地面积、适合连续生产的温和的生长环境以及降低种子扩增操作，彻底改变了生物工艺。

Univercells Technologies 的 scale-X生物反应器系列体现了新一代结构化固定床生物反应器，可提供从实验室（本研究中使用的 scale-X hydro，2.4 m² 细胞生长表面）到临床和商业生产的可扩展性（ scale-X carbo，具有 10 和 30 m²的细胞生长表面）和具有 scale-X nitro（200 和 600 m²）的 NevoLine 上游平台。Univercells Technologies 开发的生产系统通过将自动化在线 TFF 集成到与生物反应器相同的单元操作中，提供了工艺链接的可能性，从而产生高度浓缩的收获液，减少了处理材料所需的占地面积和时间。本研究使用三种不同的细胞系（原代鸡胚成纤维细胞 (CEF)、人二倍体成纤维细胞 (WI-38) 和 Vero 细胞）评估了 scale-X hydro 技术生产四种供儿童和成人使用的病毒疫苗抗原的适用性。培养条件直接从在多层细胞工厂和滚瓶中开发的预先建立的工艺中复制到生物反应器上。我们已经建立了病毒抗原产率以及细胞生长性能。

材料和方法

材料

细胞培养

细胞培养在 scale-X  hydro生物反应器（由 Univercells Technologies 开发）中进行（图1）。该系统由控制系统和可高压灭菌的一次性生物反应器组成。

图1：scale- hydro固定床反应器  (2.4 m²细胞生长表面)

后者具有螺旋缠绕的结构化固定床（专利的卷曲和亲水化 PET 非织造纤维，带有聚丙烯间隔层），细胞贴附的表面积为 2.4 m²。

固定床中的培养基循环由磁力搅拌子实现，以设定的线速度将液体向上推过固定床。一旦液体出现在床的顶部，它就会溢出到容器的外周（图2）。在工作体积下操作生物反应器，在固定床顶部和容器中的主液面之间产生高度差，从而为气体交换创造更大的表面积。

图2:专利的固定床结构和培养基液流

可以抽取预切的固定床条 (n = 12) 进行离线细胞分析。 pH 和 DO 测量是使用可重复使用的探头（分别为 EasyFerm Plus HB Arc 和 VisiFerm Arc DO 可高压灭菌探头，Hamilton Bonaduz AG）实现的。
 
液体流入和流出生物反应器是通过 4 个蠕动泵（Watson Marlow 114，Watson Marlow Fluid Technology Group）实现的。
 
在使用非原代细胞的情况下，种子是在一系列多层细胞培养瓶（2 层和 10 层 CellSTACK® (CS)，Corning）中从冻存原液制备的，以达到接种生物反应器所需的目标细胞数量，按照以下方式：冻存管解冻 > 1 x CS2 > 1 x CS10 > scale-X hydro。与 scale-X 结果进行比较的对照工艺是 850 cm² 滚瓶（用于抗原 C 和 D）和多层圆盘生物反应器系统（未公开，用于抗原 A 和 B）。

细胞检测

生物量测量是通过两种方法实现的。

方法1：通过从生物反应器中抽取预切好的非织造纤维的固定床取样条来进行离线细胞计数。在使用固定床取样条的情况下，用酶将细胞消化下来，细胞核使用结晶紫染色并使用细胞计数板计数。

方法 2：使用与生物反应器同时接种的 150 cm² 对照 T 瓶（Coring，爱迪生（新泽西州），美国）作为生物反应器内细胞的代表性测量。在使用对照 T 瓶的情况下，细胞密度通过目测（汇合度）以及酶消化后的细胞核染色（TrypLE select，ThermoFisher Scientific）进行测量。使用自动细胞分析仪（ViCell XR 细胞活力分析仪，Beckman Coulter）对收获的细胞悬浮液进行计数。

代谢物检测

在固定的时间点，从生物反应器中手动提取液体样品进行离线分析。使用生化仪（Cedex Bio Analyzer，Roche CustomBiotech）测量选定的代谢物（钙、铁、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸和氨）。

感染滴度测量

(1)除一种抗原外，所有抗原（A、B 和 C）均使用 TCID50 测定法从在培养物收获时感兴趣的时间采集的液体样本中测量。

(2)使用收获液样品的噬菌斑测定法测量抗原 D。

方法

这项概念验证研究评估了四种未公开的疫苗抗原（在下文中称为 A、B、C 和 D）在 scale-X hydro生物反应器中用于病毒生产。抗原 A、B 和 C 针对儿童疾病，而抗原 D 针对紧急成人使用。预设的接种密度、培养基使用量 (mL/cm²) 和工艺时间（用于感染）直接从对照工艺转移到固定床生物反应器，没有进行优化。

抗原A & B (CEF)

抗原 A 和 B 在原代鸡胚成纤维细胞 (CEF) 中产生。通过离心浓缩细胞，然后分别以 7.4 × 10⁵ 和 3.2 × 10⁵  cells/cm² 的接种密度接种。使它们以分批模式在固定床中循环以确保最大的细胞贴壁（通过测量从容器中提取的液体样品中剩余的悬浮细胞来估计）。一旦达到这一点，就加入含血清的培养基以达到 0.5 mL/cm² 的最终工作浓度。接种后，在细胞扩增和感染期间，培养基工作浓度降低至 0.35 mL/cm²，但其中一种抗原除外，在收获阶段培养基体积目标进一步降低至每次收获 0.08 mL/cm²。从上述每个过程步骤中收集培养基样品用于代谢物（葡萄糖和乳酸）分析。在所有情况下，还在收获步骤收集培养基样本以测量感染滴度。

抗原C (WI-38)

所研究的抗原之一（抗原 C）是使用人二倍体成纤维细胞 (WI-38) 作为细胞产物产生的。 WI-38 细胞在静态细胞培工厂中扩增，以获得足够的细胞材料，以 2.4 x 10⁴ cells/cm² 的密度接种hydro固定床反应器，最初工作体积减少，然后增加目标培养基体积 0.44 mL/cm² 和在细胞扩增期间保持不变。在再补液和多次收获操作过程中，降低到到 0.15 mL/cm²。保留培养基样品用于每个过程步骤接种、补料和收获）的代谢物分析（葡萄糖和乳酸），并对收获液进行感染性检测。

抗原D (Vero)

研究的第四种抗原（抗原 D）是在 Vero 细胞中产生的。种子在静态细胞工厂中扩增至最终种子浓度为 4.0 × 10⁴ cells /cm²。至于其他实验，接种是在减少的工作体积 (750 mL) 下进行的，然后在细胞扩增和感染期间，增加到 0.24 mL/cm² 的目标培养基体积，。在收获步骤收集样品仅用于感染性测量。

在所有细胞培养中，使用二氧化碳和氢氧化钠分别作为酸性和碱性控制，将 pH 值维持在 7.2 的固定设定点。溶氧设定值保持在 50%。在细胞贴壁和感染阶段，搅拌设置为2 cm/s 的线速度，而在所有其他处理步骤中使用线速度为1 cm/s的搅拌。

图3：抗原A和B（使用CEF）、C（使用WI-38细胞）和D（使用Vero细胞）的工艺流程图。在抗原A、B和C的生产中，在漂洗掉含血清的生长培养基之前的润洗步骤，未在本图中显示。

结果和讨论

通过这项概念验证研究，主要目标是确定在 scale-X hydro反应器中生产抗原 A、B、C 和 D 的可行性，这首先通过感染滴度来衡量。对于本文描述的所有实验，scale-X hydro 中使用的工艺条件是对照工艺中使用的工艺条件的直接复制粘贴，没有进行优化。抗原 A 和 D是进行的单步收获，而抗原 B 和C是进行的多步收获。每个感染滴度（图 4）都根据现有生产规模制造工艺（未公开）的平均对照值进行了标准化。

图 4：从抗原 A、B、C、D 的概念验证案例研究中得到的标准化传染性。实验感染性除以代表性生产传染性。抗原 A 和 B 的对照工艺是未公开的多层圆盘生物反应器系统，而抗原 C 和 D 是与 850 cm² 滚瓶工艺进行比较。

抗原 A 和 D 的特点是是单个收获步骤，在感染过程结束时收获原液。在这两种情况下，感染滴度都与对照工艺相当。抗原 B 和 C是多个收获步骤，分别为 16 和 8。在这种情况下，在每个收获步骤中，原液作为一批收获，并将新的培养基容器连接到生物反应器以继续收获。重复此操作，直到达到所需收获步骤数。虽然抗原 B 的初始收获步骤确实与对照工艺相匹配（标准化感染滴度 > 0.85），但观察到的感染滴度此后下降，这表明需要进一步优化过程以确保保持滴度。在抗原 C 的生产中，直到第 4 次收获时才达到目标感染性 (>0.85)。当从一个生产平台更改为另一个生产平台时，需要进行工艺优化是很常见的，从这方面考虑，这里观察到的结果可以是成功的（在这种技术转移的概念验证研究中，产生不可测量的传染性滴度并不少见）。

除了动态监测 pH 值、溶氧和温度（数据未展示）外，还在不同的工艺步骤中收集培养基样品，以建立代谢物档案：选择葡萄糖和乳酸作为抗原 A、B 和C的细胞生长的代表（没有抗原 D 的数据）。对于可获得结果的每个研究抗原，消耗培养基中葡萄糖和乳酸的量表明细胞在感染前生长，接种后随着病毒增殖，葡萄糖消耗减少，乳酸产量降。这种趋势证实了在对照工艺中观察到的实验测量数据（图5）。

图5：培养基葡萄糖和抗原A、B和scale-X hydro固定床反应器实验的抗原A、B的乳酸数值。抗原D的实验数据未显示。

结论与展望

本研究展示了如何将使用贴壁细胞系生产疫苗的工艺转移到创新的结构化 scale-X 固定床生物反应器中。由于这是一项概念验证研究，因此没有做工艺优化，而是直接比较抗原 C 和 D 的对照工艺滚瓶以及抗原 A 和 B 的未公开的多层圆盘生物反应器系统。抗原 A 和 D 产生感染性滴度在对照工艺的参数 (>0.85) 内，而抗原 B 和 C 的结果显示在早期收获阶段显示有前景，并为后期阶段提供优化范围。

该研究被认为是成功的，因为它为可放大平台奠定了基础，当转移到更大型号的 scale-X 系列（scale-X carbo 和 NevoLine 上游平台）时，可以从该平台生产商业化规模数量的抗原。工艺开发的下一步将侧重于优化培养条件以进一步提高滴度，并可能整合新的 pH、DO 和温度设定点策略以及优化的培养基供应。从 scale-X hydro 放大到 scale-X carbo ，也可能有兴趣评估在线 TFF 浓缩的使用，以优化收获方案，